期刊：Nature Communications
影响因子：14.7
主要时候：scRNA-seq、Xenium
导语
有计划东谈主类胎儿肺不错了解发育颓势和疾病气象如何改变肺的功能。在这里，咱们对19个健康东谈主假腺体胎儿肺组织的>150000个单细胞进行了测序，时候限制在妊娠10-19周之间。咱们从抒发丰富水平的囊性纤维化电导跨膜转换因子 （CFTR）的祖细胞中拿获动态发育轨迹。这些细胞产生多种特化的上皮细胞类型。衔尾空间转录组学，咱们展示了枢纽信号通路的时候调控，这些通路可能运行特化上皮细胞（包括纤毛细胞和肺神经内分泌细胞）的时候和空间出现。最后，咱们标明东谈主类多颖慧细胞生息的胎肺模子包含抒发 CFTR 的祖细胞，这些祖细胞拿获与自然组织中果决的相同的谱系发育轨迹。总体而言，本有计划提供了发育中东谈主肺的全面单细胞图谱，概述了细胞谱系发育的时候和空间复杂性，并对从东谈主多颖慧细胞分化到访佛发育窗口的胎儿肺培养进行了基准测试。
伸开剩余94%主要时候
scRNA-seq、Xenium
有计划效劳
1.东谈主胚胎肺的细胞组成
收罗所有19个来自采选性拆开妊娠的簇新分离的胎儿肺组织，限制从孕周（GW）10-19，并进行科罚，用于3 '单细胞RNA测序（scRNA-seq）。从肺部的不同区域对一个组织进行两次采样，以确保均匀拿获。所有对170256个单细胞进行了测序，每个细胞的读取深度约为60000。生成FASTQ文献，并将读数与东谈主类参考基因组hg 38（GRCh 38）进行比对。去除低质地细胞、死细胞和双细胞后，分析了156，698个细胞。经过圭臬化和降维后，使用倒数主身分分析（rPCA）来识别锚点，以进行整合以生成胎儿肺数据集。证据男性性别决定基因SRY和DDX 3 Y以及XIST的抒发，收罗了12个男性和7个女性的肺部（图1A）。使用基于非参数Wilcoxon品级和磨砺的各别抒发基因（DEG）来预防细胞群，将细胞群正常分为5个独到不同的细胞群（图1B）指定为矩阵（N = 98166; Col 1A 1、Col 1A 2），表皮（N = 16068; EPCAM）、内皮细胞（N = 13376; PECAM 1）、免疫细胞（N = 16258; CD 74、CD 3、NKG 7）和施旺细胞（N = 512; NRXN 1、S100 B、PLP 1）（图1C）。Clustree和DEG对每个主要细胞群进行了进一步的亚聚合，这导致发育中的肺部中所有有58种不同的细胞类型/气象（图1D）。评估统统这个词妊娠时候的细胞比例自大，在统统这个词10周的发育经过中，间质细胞组成了最大的细胞比例（图1 E）。
图1
2. 发育中的肺间质
在分析的统统肺组织中，间质细胞组成了最大比例的细胞（图1B）。咱们证据DEG确信了10种间质细胞亚型（图2A）。这些包括脂成纤维细胞、脂成纤维细胞前体、轮回成纤维细胞、早期成纤维细胞、气谈成纤维细胞祖细胞、不决型细胞、气谈平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、软骨细胞和未知的间质细胞群。脂成纤维细胞和脂成纤维细胞前体是统统这个词妊娠周中含量最丰富的间质细胞类型（图2B）。这两种细胞类型皆抒发TCF 21，这是一种先前在小鼠胎儿和成东谈主肺成脂纤维细胞中自大的标志物。脂肪成纤维细胞前体各别抒发更高水平的几种典型间充质关联基因，包括PLEKHH 2和MACF 1（图2C），访佛于小鼠脂肪成纤维细胞细胞系。在脂肪成纤维细胞中果决的最高各别转录因子JUN、FOS和STAT 3的转换子活性（图2D），已知其转换结构性细胞外基质（如胶原卵白和弹性卵白）的合成，况且在肺泡发育中很蹙迫。诚然肺泡发育发生在妊娠后期，但早期胎儿肺发育中的脂成纤维细胞在酿成气谈结构所需的ECM卵白中弘扬作用。运行脂肪成纤维细胞前体的转录因子的各别转换子活性包括NR2F1和ETV 1，其转换细胞滋长、生息和分化（图2D）。气谈成纤维细胞抒发高水平的TWIST 1、NIX和ZEB 1（图2D）。
接下来，咱们使用Xenium高分辨率多路原位空间分析来确信每个间质细胞亚型中抒发的DEG的空间定位。咱们在胎儿肺组织的间质区域中果决了与气谈成纤维细胞祖细胞（WRPINF 1、FBN 1、IGMBE 5）、脂成纤维细胞前体（MACF 1和TCF 21）和脂成纤维细胞（ERG 1、ATF 3、IRF 1）关联的基因（图2 E）。气谈成纤维细胞祖细胞主要齐集在大气谈（表皮1）周围，而脂成纤维细胞前体则出当今统统这个词间质中。此外，还不雅察到分散在表皮周围的脂成纤维细胞前体之间的脂成纤维细胞。
周期性成纤维细胞和早期成纤维细胞在早期肺组织中也以相对较高的比例存在（GW 10-14;鉴识为~ 6-10%和~ 9-12%），但在晚期妊娠肺组织中逐步减少（GW 15;鉴识为~2-5%和~3-7%）（图2B）。除了常见的胶原基因（Col 1A 1、Col 1A 2）外，周期成纤维细胞抒发了高水平的与细胞增生关联的基因TOP 2A、CENPF、MKI 67（图2C）。早期成纤维细胞抒发了高水平的与染色质重塑关联的基因，举例HELS和TYMS 29（图2D），此前已说明这些基因在小鼠胚胎成纤维细胞中高度抒发。早期成纤维细胞中具有各别性高转换子活性的转录因子包括E2 F7、E2 F8、FOXM 1、TCF 7和E2 F1。
证据UMAP展望，还有很大一部分不决型细胞与周期成纤维细胞和脂肪成纤维细胞前体密切关联（图2A）。这些不决向的细胞与轮回成纤维细胞和脂肪成纤维细胞前体有一些转录相同性，但也抒发与其他细胞类型关联的基因（图2C）。气谈SMC各别抒发更高水平的TAGLN、DES和MYH 11，而血管SMC抒发IGFBP7、MEF 2C和EGFL 6，这两种情况在其他有计划中也有访佛的报谈。TBX 5、MYEF 2和KLF 9的转录因子和关联转换因子在气谈SMC中具有各别活性，而ZFN 41、PITX 3和HMGA 1在血管SMC中存在。软骨细胞各别抒发很多胶原卵白基因，包括Col 2A1、Col 11 A1、Col 9A1和RUNX 1，以及已知转换软骨细胞发育的FOXO 1关联转换子。具有较着DEG的未知一小群间质细胞（第10群）抒发了高水平的AHSP、ALAS和BPGN，这些基因与红细胞关联。
为了推断成纤维细胞团的发育谱系，咱们使用LatentVelo来臆测不含气谈SMC、血管SMC和软骨细胞的一组间质细胞上的RNA速率。为这个子集生成了新的UMAP，咱们在UMAP镶嵌和PAGA上可视化了这些速率（图3A、B）。推断轨迹标明，周期性成纤维细胞酿成早期成纤维细胞，然后酿成气谈成纤维细胞祖细胞和脂成纤维细胞。咱们使用Slingshot进一步考据了这些轨迹，使用轮回成纤维细胞当作根细胞或细胞发源，并发现跟着细胞沿着分化轨迹挪动为脂成纤维细胞或气谈成纤维细胞祖细胞，基因抒发发生了逐步变化（图3C、D）。
图2
图3
3. 动态演变的胎儿肺细胞
在胎儿肺表皮中，对topDEG的分析加上与特定细胞关联的典型表皮基因的高抒发，揭示了19种亚型（图4A、B）。独揽SOX 2和SOX 9的抒发鉴识确信近端和远端气谈细胞，咱们果决了抒发高水平SOX 2的表皮细胞亚群，这是一种共抒发SCGB 3A2和SFTPB的CFTR抒发细胞类型（SCGB 3A2 + SFTPB + CFTR +）、SCGB 3A 2 + FOXJ 1+和SOX 2 highCFTR+祖细胞群（图4C）。通过与细胞增生关联的基因MKI 67和编码轻微管衔尾卵白CENPF、NUSAP 1和CDK 1的细胞周期基因的抒发升高来果决腾达祖细胞（图4 B）。 空间Xenium分析自大NKX 2 -1 + SOX 9 + CFTR +仅限于表皮（表皮2，蓝色暗影），统统三个基因在GW 15和18肺组织的分叉区域或发育芽区均丰富抒发（图4D）。比较之下，在气谈的茎部区域发现了MEK 2 + CFTR +细胞。已知SOX 2抒发不错转换表皮细胞的细胞增生，因此，SOX 2 highCFTR+细胞可能参与细胞扩展以酿成发育中的气谈。
使用免疫荧光染色，咱们证实了NKX 2 -1、SOX 9和CFTR三阳性细胞在发育中的肺芽区域中的空间抒发（图4 E）。相悖，在胎儿气谈中发现NKX 2 -1 + SOX 2 + CFTR +细胞，具有较着的SOX 2高（橙色箭头）和SOX 2低（白色箭头）细胞群。SCGB 3A 2 + SFTPB + CFTR +细胞在本文中被称为三重阳性（TP），各别抒发更高水平的CXCL17、CP和CYB 5A（图4 B）以及转录因子HER 1（主要的NOTCH靶基因）和ASCL 2的各别高转换子活性，ASCL 2之前被说明是肠谈表皮中的WNT/CTNNB 1转录靶点。发现这些TP细胞无数散播在统统这个词气谈中（图4D、E）。
图4
4. 推测的表皮亚型轨迹
使用LatentVelo臆测了RNA速率，以展望表皮细胞类型的谱系关系（图5A）。然后，咱们使用CellRank 分析了LatentVelo速率，并确信了三种最后气象：熟练的纤毛细胞、PNEC和芽尖祖细胞（图5B）。基于使用LatentVelo的PAGA，咱们不雅察到标明细胞高度可塑性和细胞谱系关系变化的轨迹（图5C）。假定表皮谱系的发育可能受到时候转换。基于几种典型细胞类型的出现，举例熟练的纤毛细胞和GW 14时PNEC细胞的明显下落（图5D）。在早期妊娠组织中，PNEC的孝敬有多种开端，包括从芽尖祖细胞到顶端细胞到SOX 2 highCFTR到TP，然后是PNEC的轨迹。DEG的变化反馈了细胞红运逐步改变为PNEC分化（ASCL 1和GHRL的抒发）（图5F）。沿着轨迹的细胞的富集反馈了表型的变化。在从TP细胞向PNEC转换的经过中，参与FGF、NOTCH和TGFβ信号通路的基因上调。统统的PNEC轨迹在后期削弱，况且在这些后期阶段的PNEC细胞的比例裁减（图5D）。几条轨迹聚合在妊娠中期组织中的TP上（图5E）。这些包括来自SOX 2lowCFTR+细胞、SOX 2 highCFTR+细胞、间质样细胞、增生祖细胞和基础细胞的细胞开端。在统统时候点皆不雅察到NKX 2 -1 + SOX 9 + CFTR +和SOX 2lowCFTR+细胞之间的强筹划（粗箭头线），以及后两种细胞具有TP，标明这些细胞与发育关联。咱们推断的轨迹展望（图5F、G）和Xenium空间定位标明了SOX 9+细胞之间的关系。
图5
5. PNEC和纤毛细胞谱系中TP细胞的可塑性
离体谱系跟踪有计划标明，TP细胞不错在功能上对PNEC和下呼吸谈中的纤毛细胞作念出孝敬。在咱们的数据齐集，咱们发现这些细胞后期组织中PNEC下落，GW 14周围的纤毛细胞随之加多（图6A）。CellRank用于臆测TP细胞的PNEC和熟练纤毛细胞红运概率，自大跟着GW的加多，PNEC概率下落，熟练纤毛细胞概率加多（图6B）。PNEC标志物ASCL 1（黄色）和纤毛虫细胞标志物FOXJ 1（品红色）的免疫荧光染色自大早期GW组织中富含PNEC细胞，而这些细胞在GW 18胎肺中丢失（图6C）。空间转录组学的共现分析自大，这两种细胞类型皆集合TP细胞和SOX 2+细胞，标明这些细胞位于发育中的茎区，并对气谈的谱系组成作念出孝敬（图4A、B）。一言以蔽之，这些效劳说明了PNEC和通过TP细胞的纤毛细胞分化的时候转换，撑握这些祖细胞在发育中的肺中的动态可塑性。
图6
6. FGF信号传递至TP的时候变化
相干于其他表皮细胞特异性靶向TP细胞的信号道路包括成纤维细胞滋长因子（FGF，图6D）。FGF信号道路是一种参与肺分支时势发生的已走漏路。此外，在定向分化决策中使用了几种FGF重组卵白，以从东谈主iPSC 16、18产生胎儿肺表皮细胞。因此，咱们推测该道路可能在转换TP细胞红运方面弘扬着蹙迫作用。咱们非常关爱通过FGF信号与TP细胞的细胞间互相作用（图6 D）。证据Xenium的信息，咱们果决了在空间上与TP细胞“雅致接近”的细胞，其中包括GW 15肺中的气谈成纤维细胞祖细胞、SOX 2 highCFTR+细胞、PNEC、Club细胞和基础细胞，以及脂成纤维细胞前体、SCGB 3A 2 + FOXJ 1+、气谈SMC和GW 18肺中的熟练纤毛细胞（图6 E）。然后，咱们臆测了参与TP细胞和FGF信号之间的特定配体-受体（L-R）互相作用。咱们荒谬有计划了气谈成纤维细胞祖细胞柔和谈SMC，因为它们与基于共存细胞类型的TP细胞非常接近（图6E）。咱们发现，妊娠早期（GW 10 -13）时期，波及气谈成纤维细胞祖细胞中抒发的配体FGF 2和FGF 7的L-R互相作用之间的信号传递明显加多，况且咱们发现，波及气谈SMC中抒发的配体FGF 18的L-R互相作用的信号传递明显加多（GW 14 -16）或晚期（GW 17 -19）（图6F）。
7. hPSC生息的胎儿肺分化拿获细胞异质性和在原生组织中发现的轨迹
hPSC的定向分化决策旨在捕捉发育里程碑，确保在细胞培养中真是细胞类型的放心发展。跟着分化变得愈加先进，有才气产生hPSC生息的组织特异性类器官，这些模子代表了有计划发展基本机制。当取得用于有计划的主要胎儿组织受到末端时，这少许尤其蹙迫。在这里，咱们试图使用咱们最新的肺分化决策来确信咱们以为是“胎儿”肺细胞和由hPSC产生的类器官的细胞的发育阶段（图7A）。咱们对hPSC生息的胎儿肺细胞进行了sc-RNA测序，以为其包含大部分未分化的肺上皮细胞和胎儿类器官，这些细胞将沿着分化道路进行下一步。
在聚类并进行DEG分析后，咱们将这些hPSC细胞簇的DEG与原代胎儿肺样本中的DEG进行了比较。在hPSC胎儿肺细胞中，咱们发现簇0和1中的增殖祖细胞和芽尖祖细胞有较着的调换（图7B，C）。在这些胎儿肺细胞培养中出现的其他细胞类型的DEG包括PNEC、SOX2+、SOX9+祖细胞和第2簇的TP细胞。相悖，hPSC生息的胎儿肺类器官，代表了下一阶段的分化，包含与基底细胞、club细胞、PNEC、SMG分泌细胞、纤毛细胞和TP细胞显耀调换的细胞（图7D，E）。集群0和集群2中基底细胞的高度调换并不令东谈主惊诧，因为咱们的类器官扩增培养基含有双重TGFβ/SMAD信号阻碍剂：DMH1和A83-01，它们旨在促进基底细胞扩增。
为了将这些hPSC分化细胞与胎儿肺发育的妊娠时候点进行比较，咱们使用了Spearman关筹划数，发现hPSC分化细胞与这些早期胎儿肺组织的关联性相对较强。咱们发现hPSC生息的胎儿肺细胞与<GW12肺上皮组织关联性最强，hPSC生息的胎儿肺类器官与>GW16肺上皮组织关联性最强（图7F）。蹙迫的是，莫得一种hPSC胎儿肺模子与成东谈主肺有很强的关联性。
使用邻域分析，咱们整合了hPSC开端的细胞和原代胎儿肺上皮（图8A）。详尽UMAP自大，hPSC生息的胎儿肺细胞（紫色）和类器官（绿色）与原代胎儿肺组织中的上皮细胞有较着的调换（图8B）。为显现解这些hPSC分化在多猛进程上代表了胎儿肺上皮的发育，咱们将这些细胞定位在咱们之前从自然组织推断的轨迹上。咱们研究了先前推断的胚胎初代上皮从芽尖祖细胞到TP细胞，通过顶端细胞，NKX2-1 + SOX9 + CFTR +细胞和sox2高/低CFTR +细胞的轨迹（图8C）。咱们使用集成的最左近图对集成的细胞进行聚类，况且只评估沿轨迹至少有100个细胞的聚类。因此，分析中莫得自大胎儿和hPSC开端的培养物之间细胞调换<100个细胞的集群（图8D）。
图7
图8
为了一碗水端山地确信hPSC生息培养物中沿轨迹的上皮细胞亚型，咱们从原代上皮组织中果决的每个簇的top100DEG中创建细胞类型评分，并使用每个包含hPSC胎儿肺细胞和类器官细胞的这些簇的平均拟时序，咱们沿着轨迹定位簇（图8E，上头的箭头指向轨迹场所）。这些分数标明，跟着取得与各式分化上皮细胞类型/气象（如基底细胞和TP细胞）关联的特定基因，胎儿肺类器官沿着这条轨迹逐步分化。在hPSC胎儿肺细胞簇中，增殖祖细胞类型评分跟着拟时序的加多而加多，而早期hPSC类器官簇跟着加多而脱色，而类器官中sox2高/低cftr +、TP和基底细胞类型评分则加多。基因抒发变化的澄莹模式沿着平均拟时序出现，在hPSC胎儿肺细胞中不错看到增殖祖秀雅基因的缺失（如TOP2A和CENPF），而取得了果决分化进程更高的细胞类型的基因，如sox2高/低cftr +细胞的GPC5A， TP细胞的CP和基底细胞的SPRR3（图8F）。
为了进一步证实整合细胞的分析，咱们使用LatentVelo对hPSC胎儿肺细胞和hPSC类器官进行了寥寂的RNA速率分析。与详尽轨迹分析访佛，咱们发现从hPSC胎儿肺集群0到集群1和2的轨迹（图8G），以及从hPSC类器官集群1和4到集群0和2的轨迹（图8H）。
总体而言，咱们的hPSC分化胎儿细胞模子拿获了一些上皮细胞类型/气象和轨迹，非常是从芽尖到TP细胞，以及在原代胎儿假腺/小管肺组织中不雅察到的几种中间气象（图8I）。
总之，咱们提供了东谈主类胎儿肺的高分辨率时空图谱，重心关爱上皮细胞和互相作用的基质细胞在酿成发育中的气谈中的谱系关系（图9）。
图9
导语
发育机制的再激活发生在疾病发病机制和组织建筑时期。因此，了解正常发育下细胞的可塑性以及局部细胞信号环境在决定细胞红运和功能中的作用，可能为先天性肺病、慢性疾病发病机制和细胞对拯救的反应提供枢纽主意。在这里，咱们构建了一个发育中的东谈主类胎儿肺的详尽转录组图谱，该图谱拿获了逾越 150000个胎儿肺细胞，并确信了揭示上皮区室内明显细胞可塑性的发育轨迹。通过空间分辨转录组学，咱们确信了可能决定发育中肺内细胞红运和活动的推定时候转换的细胞信号传导互相作用。最后，咱们揭示了hPSC的分化沿着相同的发育轨迹进行，并产生与在东谈主胎儿肺上皮中不雅察到的相同的胎儿细胞类型/气象。
影响细胞红运决定的发育经过是由细胞微环境中精准的细胞间信号传导互相作用介导的。诚然细胞可能分享转录组基因特征，但细胞自主或非细胞自主信号转导可能决定这些细胞如何发育。在这里，咱们专注于上皮-上皮细胞和上皮-基质细胞之间的信号传导通信。但是，它并不舍弃免疫、内皮和神经（雪旺）细胞的孝敬，这些细胞亦然共同发育并居住在前两种细胞类型左近。事实上，免疫细胞群对上皮发育的孝敬最近已在胎肺中得到证实。相应地，咱们在上皮细胞的轨迹分析中看到了白细胞介素通路的抒发，这可能标明来自免疫细胞的信号传导。在咱们的细胞通信和轨迹分析中，咱们自大了靶向 TP 细胞的FGF、WNT和 NOTCH信号通路的时候变化。信号转导的空间和时候转换皆不错改变细胞长短不一的微环境，并影响其活动和潜在的细胞红运变化。为了阐发咱们的效劳，使用Xenium来优化上皮细胞和基质细胞类型的空盘曲近度，并通过TP分析了推定的信号转导。
咱们有计划的一个蹙迫方面是 hPSC 生息的胎肺分化的基准。在这里，咱们标明 hPSC 生息的胎儿肺细胞和类器官拿获了在自然组织中不雅察到的几种胎儿特异性细胞类型/气象和分化轨迹。具体来说，咱们标明分化的 hPSC 生息的胎儿肺细胞主要代表增殖细胞和祖细胞，而 hPSC 生息的胎儿类器官包含代表肺发育后期的分化细胞。由于并非统统细胞类型和轨迹皆在 hPSC 分化中被拿获，因此改日的有计划可能会独揽 LR 互相作用的展望和特定信号通路的富集来修改现时的分化决策并改善体外其他上皮细胞类型的产生。总体而言，咱们的责任撑握使用 hPSC 生息的胎肺上皮模子当作有计划胎肺上皮谱系发育的潜在替代模子。蹙迫的是，hPSC 分化是执行上易于科罚的模子，可用于有计划更正常的发育限制和疾病的胎儿发源，这使得这些模子的基准测试和考据尤为蹙迫。
总之，咱们的有计划确信了有助于早期东谈主类胎儿肺上皮动态发育的细胞类型、气象、轨迹以及局部细胞和信号互相作用。了解东谈主类胎儿肺细胞千般性尽头在发育中的作用将革命现时 hPSC 的分化决策，从而为改日先天性和慢性肺病的拯救生成更好的类器官模子或实在的细胞类型。
参考文献：
Quach H, Farrell S, Wu MJM, Kanagarajah K, Leung JW, Xu X, Kallurkar P, Turinsky AL, Bear CE开yun体育网, Ratjen F, Kalish B, Goyal S, Moraes TJ, Wong AP. Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity. Nat Commun. 2024 Jul 13;15(1):5898. doi: 10.1038/s41467-024-50281-5. PMID: 39003323; PMCID: PMC11246468.
发布于：上海市